重组蛋白瞬时转染体积最大化，如何在摇瓶中实现？

重组蛋白作为生物制药的产物，在医学上发挥着举足轻重的作用。利用基因工程技术，可以将细胞或动物本身变成 “大量生产药物的工厂”。哺乳动物细胞培养、表达以及制备治疗性重组蛋白药物已成为当前生物制药领域的主流技术。哺乳动物细胞瞬时转染系统不仅产量高，还具有与天然蛋白质相似的理化性质和生物学功能。

 

康宁 5L PETG 摇瓶(Corning Cat. No. 431284) 专为悬浮培养而设计，不仅考虑到空间效率，同时支持 CHO 细胞系扩增和重组蛋白表达。PETG 材料不会抑制细胞生长，同时也针对增加气体交换进行了优化，为悬浮细胞提供良好的生长条件。

 

小 C 将与大家分享在康宁 5L 摇瓶中瞬时转染 CHO 细胞表达蛋白的方法，该方法可以提高重组蛋白的产量。同时比较了康宁5L PETG摇瓶与同类品牌的5L聚丙烯（PP）摇瓶的性能。

 

实验方法

细胞培养

将 ExpiCHO-S 细胞（Thermo Fisher Cat. No. A2910001）培养在 ExpiCHO 表达培养基（Thermo Fisher Cat. No. A2910001）中，培养在 37℃，8%CO₂ 摇床中，50mm 轨道直径的摇床转速设定为 110±5rpm。为了将细胞维持在生长对数期，一般在培养 2~3 天时，细胞密度会达到 3~4×10⁶/mL ，此时需要进行传代，传代后细胞密度为 0.2~0.4×10⁶/mL。

 

重组蛋白瞬时转染

本文使用 Expression plasmid (Thermo Fisher Cat. No. A14662)的衍生物。转染前一天接种细胞，使细胞过夜增长后密度达到 6×10⁶/mL以上，活率大于 95%。转染当天，将细胞密度稀释至 6×10⁶/mL，使用 ExpiCHO 表达系统试剂盒（Thermo Fisher Cat. No. A29133）进行 ExpiCHO 转染。

 

在 1L 的转染体系中，将 0.8~1mg 的质粒稀释在 40~50mLOptiPro（包含在 ExpiCHO 表达试剂盒中），倒置混匀（A 管）；将 0.8~1mL ExpiFectamine™ CHO（包含在 ExpiCHO 表达试剂盒中）稀释在另一管40~50mL OptiPRO 中，倒置混匀（B 管）。将 B 管以 1：1 的比例倒入 A 管中，倒置混匀，室温下静置 1~5min。将混合液倒入细胞培养瓶中，摇晃培养瓶使其充分混匀后，将摇瓶放回摇床中继续培养，将转速降低10rpm。此时定义为第0天。

 

在转染后 18~22h，加入 150µL/L ExpiCHO Enhancer（包含在 ExpiCHO 表达试剂盒中）和 4mL/L ExpiCHO™ Feed (Max Titer)（包含在 ExpiCHO表达试剂盒中），并将培养温度降低至 32℃。转染第四天再次加入 4mL/L ExpiCHO™ Feed (Max Titer)（包含在 ExpiCHO 表达试剂盒中）。再培养 12~14 天后收获。

 

 

实验结果

细胞在转染后第 2 天密度达到峰值为 1.1 x 10⁷ cells/mL。到第3 天，细胞密度会降至 7. 6 x 10⁶/mL。转染 4 天后，细胞密度缓慢降至 5 x 10⁶/mL。转染后细胞活力保持在 80% 以上长达 12 天（图1和图2）。

图1. 康宁与其他品牌转染后 ExpiCHOS-S 细胞密度

图2. 康宁与其他品牌转染后 ExpiCHOS-S 细胞活率

 

在转染后第 2、6 和 12 天检测蛋白质表达水平。结果显示在转染后第 6 天，康宁 5L 摇瓶中的蛋白质表达水平显著高于对比品牌 5L 摇瓶中的蛋白质表达水平。在转染后第 12 天，康宁 5L 摇瓶中蛋白质表达量达到峰值为 120 mg/L，同时检测对比品牌 5L 摇瓶中蛋白质表达量为 55 mg/L（图 3）。

图3. 康宁与其他品牌重组蛋白表达量分析

 

结论

• 康宁 5L 摇瓶可以支持高密度的 ExpiCHO-S 细胞瞬时转染。

• 重组蛋白的高水平表达源自于优化设计的康宁 5L 摇瓶，其较高的液体表面积与体积比使得氧气和二氧化碳更好的进行气液交换。