小C讲堂第23讲——让您的细胞侵袭实验更简便

细胞侵袭实验提供了一个研究细胞侵袭能力的体外系统。具体应用包括评估肿瘤细胞的转移潜能，细胞外基质成分或抗肿瘤药物抑制转移的作用，转移细胞中细胞表面蛋白或基质金属蛋白酶的表达改变；正常细胞如胚胎干细胞、细胞滋养细胞、内皮细胞和成纤维细胞的侵袭能力。

 

包被康宁Matrigel® 的穿透性小室为体外研究细胞的侵袭性提供了一个相对简便的方法。康宁 Matrigel在体外作为重组的基底膜，封闭膜的小孔并阻止非侵袭性细胞穿过膜迁移。侵袭性细胞（恶性和非恶性）分泌蛋白酶，并通过酶促降解康宁Matrigel进而通过膜孔侵入。膜可以通过光学和电子显微镜观察，且在染色后可以很容易地切下。本期小C讲堂，将手把手与大家分享具体的实验步骤。以下操作步骤已针对 HT-1080 人纤维肉瘤细胞在康宁Matrigel 包被的穿透性小室（24孔，8.0 μm 孔径，如康宁货号3422或3464）上进行了优化。结果可能因实验条件而异，包括细胞、培养基、孵育时间、细胞接种密度和化学诱导物（趋化因子或血清等）。因此，应针对每个具体实验系统进行优化，包括Transwell孔径的正确选择。

 

实验步骤

 

1.0包被步骤

1.1 将Matrigel埋在冰盒里，置于 4°C 冰箱中过夜融化。融化后，旋转瓶身以确保Matrigel均匀分散。将Matrigel在冰上使用无菌技术进行分装等操作。

注意：让包被缓冲液在冷室或冰箱的冰浴中冷却两个小时。 任何与 Matrigel接触的吸头、注射器或容器在使用前都必须预冷。

1.2 制备包被液：将 Matrigel 与包被缓冲液混合（最终浓度为200 至 300 μg/mL），通过轻轻旋转彻底混合含有 Matrigel 的包被液。

注意： 您可根据您的细胞种类、侵袭能力等优化Matrigel 包被浓度，并通过预实验进行验证。

1.3 使用无菌注射器或移液器小心地将 0.1 mL Matrigel 包被液添加到每个小室。 尽量减少 Matrigel 与小室侧壁的接触。

1.4 在 37°C 下孵育包被的小室2小时。 在使用前小心地除去小室中剩余的液体（包被缓冲液），请勿触碰小室底部，以免破坏膜上包被好的Matrigel。包被好的小室即可接种细胞了。推荐您在包被的当天使用包被好的小室。

 

2.0 侵袭步骤

2.1 准备相同数量的对照（未包被）小室。

2.2 为侵袭实验准备细胞，根据您的要求培养细胞（例如，培养基、血清浓度、汇合度）。对于 HT-1080，我们建议培养至约 70% 至 80% 的汇合度，然后再接种至小室中。

2.3 准备适量的细胞，用于 24 孔板的小室。在每个 24 孔小室中加入相应的细胞悬液。

注意：要确定您的细胞类型在小室生长表面的最佳接种密度，请依据在普通培养器皿上的正常接种密度设定区间（细胞数/cm²）。 例如，如果您当前以 1 x 10⁵ 个细胞/cm²接种密度培养，则可大约在 5 x 10⁴ 到 5 x 10⁵ 个细胞/cm²之间确定最佳接种密度。

2.4 在孔板中加入培养基（含化学诱导物，如趋化因子或血清），同时设置无化学诱导物的对照组。

注意：确保在小室下方没有气泡。

2.5 在 37°C、5% CO₂ 的培养箱中培养12-24 h（孵育时间需要通过预实验优化以确定）。

 

3.0 检测

3.1去除未侵袭的细胞

去除孔板和小室中的培养基。将用培养基蘸湿的棉签伸入小室的上部，以平缓但稳定的力度按压，同时轻柔擦拭整个区域。另取一支棉签，用培养基润湿后重复上述步骤。

3.2细胞染色

注意：细胞染色可选择不同的方法，包括Diff-Quik试剂盒染色，H&E染色，结晶紫染色或1% 甲,苯胺蓝染色。具体染色方法可参考选用的染色试剂说明书。

3.3计数侵袭细胞

注意：通过显微镜对附着在小室膜下侧的细胞进行图像采集，用于细胞计数。也可以直接镜下计数细胞。

注意：计数细胞时， Transwell膜中心的视野和膜边缘的视野都需要选择，以便准确体现示穿过整个膜的细胞数。

确定侵袭细胞百分比有两种方式。

第一种方式：

A．计数随机选取的小室视野中的细胞总数并取平均值（每孔请至少选取5个视野进行计数）。

示例：203、210、220、206 和 213，平均值 = 210

B．将此数字除以显微镜视野的面积，然后将其乘以Transwell 小室的膜面积。

示例：(210 / 0.001 cm²) x 0.33 cm² = 69,300 个细胞

C．侵袭百分比可以通过将侵袭的细胞数除以接种的细胞数来计算。

第二种方式：

示例：(69,300/100,000) x 100% = 69.3%

 

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