Corning Elplasia 12K 开孔板使用秘籍

Corning Elplasia 12K开孔板的设计与Corning Elplasia 12K培养瓶相似，其透气性 PS 薄膜底部每平方厘米含有152个微腔，能够在同一培养条件下直接生成大量大小均一的细胞球。不过，Elplasia 12K培养板采用了微孔板尺寸和可拆卸盖设计，易于进行细胞球的采样和成像（ 图1 ） 。借助重力、康宁超低吸附（ULA）表面以及圆形微腔，可形成约12,000个形状和大小一致的细胞球。培养基更换端口（图2）能够在移液时尽可能减少对细胞球的破坏。微腔的几何形状有助于细胞球在培养过程中保持原位，收集时不影响操作/细胞球回收。Elplasia 12K培养板为无菌产品，可直接使用。

 

根据细胞类型、接种密度和培养时间的不同，细胞培养条件和操作需要进行一些优化。强烈建议您使用前仔细阅读本使用指南的全部内容。

 

图1. Corning Elplasia 12K开孔板采用了标准ANSI/SLAS微孔板尺寸和可拆卸盖设计

 

图2. Corning Elplasia 12K开孔板图片。箭头所指是专为移液步骤设计的培养基更换端口

 

 

材料

• Corning Elplasia 12K开孔板（货号：4547）

• 润湿剂（35-70%乙醇溶液）

• 细胞培养级水

• 1X磷酸盐缓冲液（PBS)

• 单细胞悬液

• 细胞培养基

• 培养基更换端口能够在移液时尽可能减少对细胞球的破坏

 

操作流程

微腔表面预浸润

在接种细胞之前，应预先浸润微腔表面，以确保细胞悬液能够进入每个微腔。建议使用0.2μm无菌过滤的乙醇（EtOH）溶液（35%-70%，溶于细胞培养级水）作为该步骤的润湿剂。也可以在300xg下短暂离心Elplasia 12K培养板（<3分钟），使液体进入微腔。

 

建议的预浸润体积

润湿剂：5-10mL

离心：10-13mL 1X PBS或细胞培养基

 

浸润方法

1. 将Elplasia 12K培养板从初级包装中取出，放于生物安全柜中，橙色的保护托盘可以拆下。

2. 取下盖子，用血清移液管将5-10mL润湿剂（经过0.2μm过滤的≥35% EtOH）加入其中一个培养基更换端口。

3. 使润湿剂充分分布在微腔表面，并在不施加外力的情况下让润湿剂进入微腔。当润湿剂进入微腔时，微腔将变得透明。如果润湿剂没有进入微腔，微腔内有气泡，会显示为不透明的区域。如果微腔内有气泡，悬浮的细胞就不会沉降到该微腔中。

**注意：可能需要轻轻搅动/旋动或轻轻敲击Elplasia 12K培养板侧面和边缘，以充分润湿表面。避免泼溅润湿剂或直接接触底部的微腔表面。将润湿剂上下吹打也有助于润湿表面。

4.  通过其中一个培养基更换端口吸去润湿剂。

5.  加入15 mL细胞培养级水，冲洗微腔表面，以去除微腔中残留的润湿剂。吸去液体。

6.  再用1x PBS冲洗两次，以去除残留的润湿剂。

离心法

预浸润步骤可以使用1X PBS或细胞培养基。建议体积为10-13mL，300xg离心。液体切勿超过13mL，相对离心力（RCF）不得高于500xg，否则离心时液体可能会溅出Elplasia 12K培养板。RCF超过1,000xg会损坏Elplasia 12K培养板。将Elplasia 12K培养板放入离心机时，培养基更换端口应面朝外（远离转头），以免离心时液体溢出。

 

1. 将Elplasia 12K培养板从初级包装中取出，放于生物安全柜中，橙色的保护托盘可以拆下。

2. 取下盖子，用血清移液管将10-13mL 1X PBS或细胞培养基加入其中一个培养基更换端口。

3. 使液体充分分布在微腔表面并进入微腔。可能需要轻轻搅动/旋动Elplasia 12K培养板，以充分润湿表面。

4. 盖上盖子，将Elplasia 12K培养板转移到离心机中。放入离心机时，培养基更换端口应面朝外（远离转头），以免离心时液体溢出。

5. 300xg离心3分钟。根据培养基的不同，可能需要延长离心时间、提高转速。RCF切勿超过500xg，体积不得超过13mL。

6. 从离心机中取下Elplasia 12K培养板，可能需要轻轻搅动/旋动培养板，以便液体重新分布。

**注意：微腔表面预浸润完毕后，Elplasia 12K培养板可直接用于接种细胞。也可以将培养板暂时存放在生物安全柜或细胞培养箱中，直到可以接种细胞。如果微腔表面因长时间放置而变干则需要重复润湿流程。

 

细胞接种

Elplasia 12K培养板的最佳接种密度取决于多种因素，如细胞类型、培养时间以及所需的细胞球大小。

1. 使用完全培养基以所需的接种密度制备细胞悬液（建议20-30mL的接种体积）。

    • 微腔密度约为每块Elplasia 12K培养板12,160个微腔（152个微腔/cm²）。

例如：如果每个微腔接种800个细胞，则共需要970万个细胞（800个细胞 x 12,160个微腔）。

    • 为确保为单细胞悬液，在接种前使用70μm细胞筛网过筛。

    **注意：细胞可以从解冻复苏后直接接种到Elplasia 12K培养板中。

2.吸去预浸润后残留的液体，然后通过其中一个培养基更换端口加入细胞悬液。让细胞悬液完全分布在微腔表面，轻轻旋动培养板，使其均匀分布。液面应完全覆盖微腔表面，但不能完全装满Elplasia 12K培养板。

3. 盖上盖子，将Elplasia 12K培养板转移到细胞培养箱中。

**注意：培养板应静置至少24小时，以免影响细胞球的形成。

 

培养基更换

Elplasia 12K培养板的微腔深度足以实现轻柔换液，但也不会过深，使得细胞球难以回收。在更换培养基时，必须使用培养基更换端口，以防止细胞球损失。最小工作体积建议为20mL，最大工作体积为30mL；最佳体积取决于细胞类型和培养基更换频率。建议至少每3-4天更换一次培养基，以免蒸发引起培养基损失。

 

更换培养基时，需要使Elplasia 12K培养板保持水平。不过也可以将与培养基更换端口相对的短边抬高3-4°，促使液体流向端口，以便能够完全吸去液体，并减缓新培养基加入Elplasia 12K培养板中时的流动速度。如果选择抬高培养板，应当尽量减小抬高的角度，以防止液体溢出。在更换培养基时，可以使用约0.25英寸 (6.35mm) 的物品将Elplasia 12K培养板的侧边抬高到建议的3-4°。

 

1. 将Elplasia 12K培养板转移到生物安全柜中，取下盖子。

2.使Elplasia 12K培养板保持水平，也可以将与培养基更换端口相对的短边轻轻抬高（0.25英寸/6.35mm），或者在下方放置一个物品（如50mL离心管盖或血清移液管）将其抬高，以达到建议的3-4°（如图3所示）。

3.  将血清移液管的吸头放入其中一个培养基更换端口，吸出培养基，弃去用过的培养基。

4.  加入培养基时，将血清移液管的吸头以稍微倾斜的角度放入其中一个培养基更换端口（如图4所示），缓慢向Elplasia 12K培养板中添加新鲜培养基。

**注意：如果将移液管吸头垂直于Elplasia 12K培养板放入培养基更换端口，在加入液体时，对端口附近微腔中细胞球的扰动可能会更大。

5.培养基更换完毕后，轻轻取出抬高物品（若有），将Elplasia12K培养板放回水平位置，盖上盖子，并放回细胞培养箱中。

图3. 建议的抬高位置，以便能够完全吸去液体。图中范例使用的是25mL血清移液管

 

图4. 在培养基更换端口加入培养基时移液管吸头的建议位置，吸头稍稍倾斜

 

细胞球收集

根据下游实验的需求，可以按照上述方法从Elplasia 12K培养板中收集细胞球，也可以直接在Elplasia 12K培养板中将细胞球解离成单细胞。

1. 吸去用过的培养基，按培养基更换部分所述加入15mL 1X PBS。

    • 可能需要进行第二次1X PBS冲洗，以去除残留的培养基。

2. 吸去缓冲液，然后加入5-10mL解离试剂。让液体充分分布在表面。

3. 按照解离试剂实验方案对细胞球进行孵育。

    • 待可以解离时，细胞球会显得更大，且形状会变得不规则。

4.旋动Elplasia12K培养板，帮助细胞球脱离，上下吹打悬液几次以便充分解离细胞球。

5.  使用等体积的含血清培养基中和/稀释解离液，并将细胞悬液转移到一个单独的收集容器中。

    • 可能需要对微腔表面进行额外的冲洗，以回收所有的细胞。

6. 为确保收获的是单细胞悬液，可使用70μm的细胞筛网过筛。

 

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