血管生成是一个复杂有序的生物过程，包括内皮细胞迁移、侵袭和分化为毛细血管。体外内皮细胞成管实验是研究血管生成的经典方法，可用于研究内皮细胞分化以及血管生成蛋白对内皮细胞成管的调控。

今天小 C 就和您分享，如何正确操作内皮细胞成管实验。

 

步骤

1.0 包被

1. 根据使用指南融化康宁Matrigel。使用预冷的移液管，将其混合均匀。

2. 将24 孔培养板放置在冰上，每孔加入0.289 mL Matrigel（10 mg/mL）。

3. 加Matrigel时避免引入气泡，如有，请在预冷至4°C的离心机中以300xg将 24 孔培养板离心10分钟。

4. 将24 孔培养板在 37°C孵育30 至 60 分钟。

 

2.0 内皮细胞成管

1. 用所需的内皮细胞培养基培养内皮细胞至所需的汇合度。对于康宁HUVEC-2、HMVEC和HMEC-1，建议汇合度为70%至80%。

注意：原代细胞应使用代数靠前的（例如，HUVEC的传代次数不应超过5次）。

2. 使用康宁HUVEC-2、HMVEC 或 HMEC-1 细胞时，通过胰蛋白酶消化细胞并将细胞重悬于含5% 至10% 血清或所需的血管生成刺激因子的培养基中，内皮细胞悬液含4 x 10⁵个细胞/mL。培养基中可以加入其他测试物，例如血管生成抑制因子。

注意：大多数内皮细胞培养基不含足够浓度的血清来灭活胰蛋白酶。建议使用胰蛋白酶中和溶液。

3. 每孔加入300 μL 细胞悬液（1.2 x 10⁵个康宁 HUVEC-2、HMVEC 或 HMEC- 1）。

4. 将24孔培养板在 37°C、5% CO2培养箱中孵育16 至 18 小时。

 

3.0 血管生成的测量 – 使用康宁钙黄绿素AM进行标记

1. 以8μg/mL制备康宁钙黄绿素AM溶液。每块板需要9.0mL康宁钙黄绿素AM溶液。如果使用两个50μg小瓶，量取12.5mL 的 HBSS 并加热至 37°C。向每瓶 50μg康宁钙黄绿素AM中加入20μL DMSO，然后将两个样品瓶的内容物转移到12.5mL的HBSS 中，得到8μg/mL的溶液。

2. 小心地从培养板中移除培养基。注意不要干扰康宁Matrigel中形成的管。

3. 向每个孔中加入750μL HBSS 进行漂洗，然后移除 HBSS。

4. 重复洗涤一次。

5. 每孔加入300μL的8μg/mL康宁钙黄绿素AM标记细胞，并在37°C、5% CO2培养箱中孵育30至40分钟。

6. 移除康宁钙黄绿素AM溶液。

7. 用HBSS漂洗板子两次。

8. 该板现在可以使用自动成像仪采集图像或使用荧光显微镜拍照。

注意：一旦发生水解，康宁钙黄绿素AM就会从细胞中泄漏出来，导致较高的背景。培养板可以在4°C下储存1至2小时。

9. 使用所需的硬件和软件处理采集的图像。