细胞冻存目前已是一项成熟的实验技术，能够以接近液氮的温度 (−196°C) 保存细胞和其它生物材料。它可为研究人员提供备份材料，应对因污染而造成的细胞损失，并且能够在当前培养物生长时间过长时重新使用早期传代细胞，有助于降低遗传漂变的风险。那么，如何冻融细胞以维持高细胞活性呢？下面就来听小C给大家讲一讲细胞冻融的实用技巧吧！
 
01 在冷冻前检查细胞健康状态

理想情况下，细胞应在传代次数较少时冷冻，此时细胞特性未因长时间传代而出现改变。在冷冻细胞前，必须使用台酚蓝或其它活细胞/死细胞染料进行活细胞计数，并通过无菌检查和支原体检测检查细胞是否出现污染。

 

02 在对数生长期以适当的浓度冷冻细胞

在冷冻前1–2天传代细胞或更换培养基，可确保细胞健康且处于活跃生长期。例如，贴壁细胞最好在达到70–80%汇合时收集细胞进行冷冻。细胞冷冻时的浓度可能因培养物的不同而异，但一般为1 x 10⁶–5 x 10⁶个细胞/mL冻存培养基；冷冻细胞的密度过低或过高均会影响细胞活性，应予以避免。

 

03 使用适当的冻存培养基

冻存培养基通常包含生长培养基、冷冻保护剂 (如DMSO或甘油)以及蛋白质来源(通常为血清)等成分。冷冻保护剂对于防止细胞冻融过程中的细胞应激至关重要，但也可以不使用血清；在需要避免使用血清的情况下，可以在生长培养基中添加无血清条件培养基或10%细胞培养级BSA。

 

04 尽快开始冷冻过程

在将冻存培养基加入细胞后，应尽快开始冷冻，以维持细胞活性。在冻存管转移至冻存盒之前将其置于湿冰上有助于加快这一过程。

 05 缓慢冷冻细胞

缓慢冷冻细胞对于防止细胞内冰晶形成至关重要，可以使用冷冻速率为1°C/分钟的冻存盒来实现该过程。将含有细胞的冻存管放入冻存盒后，应置于-80°C条件下至少4小时，最好过夜。不含异丙醇的系统较常规乙醇替代方法成本更低、使用更加便捷，而且冷冻更均匀，可以保护细胞活性，比如CoolCell®细胞程序降温盒是不错的选择。

 06 检查冻存细胞后再转移至液氮中

将细胞置于-80°C条件下冷冻后，取其中一管细胞进行检测，确认冻存细胞具有活性且未受污染，然后再将其它冻存细胞转移至液氮中，这一点非常有用。不过，将细胞长时间置于-80°C条件下会影响细胞的健康状态，应在检查结束后尽快将其它细胞转移至液氮中。

 07 将细胞保存于气相液氮中

细胞应保存在气相液氮中，以防止液体进入冻存管。液体进入不仅会造成污染，还会在解冻时因液体膨胀而导致冻存管受损。

 08 在解冻细胞前确保细胞处于冷冻状态

切勿将冻存的细胞从液氮转移至实验室的湿冰上，以免细胞活性受到影响。应始终使用干冰或液氮容器，尤其是需要远距离或长时间运输细胞时。

 

09 快速解冻细胞

将细胞从液氮中取出后，应立即迅速将冻存管置于37°C水浴中，直至内容物解冻。随后立即将细胞转移至较大体积的预热培养基中，对于敏感性较高的细胞(干细胞、原代细胞)，应逐滴添加，以保护其活性。有些细胞可能需要先离心形成细胞沉淀，然后再用移液器轻轻重悬细胞，加至含有预热培养基的培养瓶中。还有些细胞最好在解冻后直接转移至培养瓶中(更温和)，并在第二天更换培养基，去除残留的冷冻保护剂。

 10 确认近期解冻细胞处于健康状态

快速目视检查可以提供早期细胞健康指标，例如，确认贴壁细胞已粘附在培养瓶上。可在早期代传后检查细胞存活率，进一步确认观察结果。